AT1受體拮抗劑和ACEI對大鼠心肌肥厚時AT1,mRNA表達的影響 h2受體拮抗劑

來源:公文書信 發布時間:2019-07-23 04:49:55 點擊:

  [摘要] 目的 探讨血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)及其受體AT1在心肌肥厚中的作用,研究DMP811(AT1受體拮抗劑)、培哚普利(ACEI)對AngⅡ誘導的心肌肥厚大鼠心肌AT1 mRNA表達水平的影響。 方法 24隻6周齡的SD雄性大鼠随機分為4組:正常對照組、AngⅡ組、AngⅡ+DMP811組、AngⅡ+培哚普利組,每組6隻。分别皮下埋藏裝有生理鹽水或AngⅡ的滲透微泵。1周後觀察心髒質量、心髒質量/體質量的變化,采用反轉錄聚合酶鍊反應(RT-PCR)檢測心肌AT1mRNA表達情況,并進行比較。 結果 ①輸注AngⅡ 7 d不會明顯影響大鼠的體質量,但可使大鼠的心髒質量、心髒質量/體質量顯著增加。AngⅡ組較正常對照組心髒質量、心髒質量/體質重明顯增加(P0.05)。②AngⅡ組的AT1 mRNA水平較對照組上調(84.5±3.0)%(P0.05)。 結論 心肌肥厚時AT1 mRNA的表達水平明顯增加,且AngⅡ誘導了AT1 mRNA的轉錄上調。而AngⅡ導緻的上述改變能被DMP811、培哚普利有效阻斷,為以後防治心肌肥厚提供了重要依據。
  [關鍵詞] AT1受體拮抗劑;培哚普利;心肌肥厚
  [中圖分類号] R972 [文獻标識碼] A [文章編号] 1674-4721(2013)09(c)-0004-03
  心肌肥厚指心髒大小、形狀、質量及細胞水平的各種變化。長期的心肌肥厚很容易導緻心力衰竭或猝死[1]。心肌肥厚時,尤其是室間隔的非對稱性肥厚、心律失常、運動耐量受損及猝死,是一種原發于心肌的疾病[2]。分子遺傳學研究表明,心肌肥厚是心肌标志蛋白表達水平升高,心肌細胞體積增大,同時伴随心髒質量增加的過程[3]。腎素-血管緊張素系統(renin angiotensin system,RAS)在引起心肌肥厚的諸因素中具有重要的作用[4],它可以維持血壓、機體内環境的穩定平衡,也調節細胞的生長、分化,尤其調控多種慢性疾病的組織改建和器官重構[5]。RAS屬于循環系統激素,其中關鍵物質是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ),它是重要的促心肌肥厚因子,具有強烈的收縮血管作用[6],其亞型血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)的活化參與了AngⅡ的大部分生物學效應。因此研究AT1發揮作用的機制及其受體拮抗劑的作用,對于了解心肌肥厚的形成,制訂合理的預防和逆轉措施,有着極其深遠的意義。
  1 材料與方法
  1.1實驗動物與材料
  雄性SD大鼠24隻,體重150~170 g,6~8周齡,購自重慶騰鑫生物技術有限公司,所有動物均自由飲水和攝食,并給予人性化管理。AngⅡ購自美國SIGMA公司,DMP811由美國SIGMA公司贈送,2001型微量滲透泵購自美國健康醫療儀器國際公司。
  1.2 實驗方法
  1.2.1 動物模型的建立及分組 将24隻雄性SD大鼠随機分為4組,每組6隻,适應性喂養1周後,水合氯醛腹腔注射麻醉,皮下分别給予裝有生理鹽水或AngⅡ的滲透微泵。①正常對照組:輸注生理鹽水(1 μl/h);②AngⅡ組:輸注AngⅡ[200 ng/(kg·d)];③AngⅡ+DMP811組:輸注AngⅡ+DMP811管飼[3 mg/(kg·d)];④AngⅡ+培哚普利組:AngⅡ輸注+培哚普利管飼[10 mg/(kg·d)],直至術後1周處死。
  1.2.2 血流動力學檢測 分别于手術當天、第3天、第7天測量動物的體質量(body weight,BW),術後1周斷頭處死大鼠,取其心髒,去掉心房及殘餘組織,隻留下心室。并用PBS緩沖液洗淨心腔殘存血液之後用濾紙吸幹,稱重,并計算心室質量(cardioc weight,CW)與大鼠體質量之比(cardioc weight/body weight,CW/BW)。立即液氮速凍,之後存于-70℃冰箱備用。
  1.2.2 心肌AT1 mRNA檢測 實時熒光定量反轉錄聚合酶鍊反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測大鼠心肌組織AT1 mRNA:标本解凍後,立即超聲破碎細胞,裝于EP管并置于冰上,于4℃條件下12 000 r/min離心10 min。取上清液轉移至DEPC預處理的EP管中,室溫放置5 min使樣本充分裂解。采用Trizol法提取心髒組織RNA,在測量儀上定量,之後于-70℃保存。電泳結果顯示三條RNA條帶,分别為28S、18S、5S依次清晰遞減,泳道上無明顯彌散痕迹,說明總RNA提取完整無明顯降解,滿足後續實驗要求。将組織中提取的總RNA以其中的mRNA作為模闆,采用Oligo(dT)或随機引物反轉錄成cDNA,根據目的基因序列設計探針和引物,在PCR儀上進行擴增。内參對照選定管家基因GAPDH,引物由TaKaRa公司合成并經質量檢測。反應體系在FTC2000型熒光定量PCR儀上進行,反應條件:94℃預變性2 min,然後94℃變性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,進行45個循環。在PCR反應過程中,設定無cDNA樣品的空白管作為陰性對照。AT1上遊引物:5′-CACCTATGTAAGATCGCTT-3′;下遊引物:5′-GATGATGATGCAGGTGACT-3′;擴增片段長度:162 bp;GADPH上遊引物:5′-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′;下遊引物:5′-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3′;擴增片段長度:177 bp。   1.2.3 熒光定量PCR 按10倍梯度将一待測cDNA樣品稀釋,在相同條件下進行PCR擴增,橫坐标為樣品拷貝數的對數,縱坐标為CT值,拟合AT1 mRNA及GAPDH的熒光定量PCR标準曲線。在目的基因和管家基因擴增效率一緻的基礎上,以2-ΔΔCT表示目的基因的相對表達量,CT值代表每個反應管内的熒光信号達到設定的阈值時所進行的循環數。以各樣本的CT值減去其對應的内參照基因GAPDH的CT值得到ΔCT值,取一個參照組的ΔCT值的平均值作為對照基準,用每個标本的ΔCT值減去參照組的ΔCT值,得到ΔΔCT。計算2-ΔΔCT值,并統計各組之間的差異性。2-ΔΔCT值的意義:每個樣本的基因的表達是參照組的基因表達平均值的多少倍。
  1.2.4 統計學處理 使用SPSS 13.0統計學軟件,計量資料以均數±标準差(x±s)表示,兩組間比較用t檢驗,多組間比較采用方差分析,以P0.05)(表1)。
  2.2 各組心肌組織AT1 mRNA表達
  輸注AngⅡ7 d,對照組AT1 mRNA水平為8.680±9.53,AngⅡ組AT1 mRNA水平為16.033±13.71,AngⅡ+DMP811組AT1 mRNA水平為5.410±4.75,AngⅡ+培哚普利組AT1 mRNA水平為5.685±0.30,較對照組上調(84.5±3.0)%(P   [5] 王曉紅,劉進軍,于緯.卡托普利影響壓力負荷性大鼠肥厚心肌血管緊張素Ⅱ1受體和2型受體表達[J].中國動脈硬化雜志,2006,14(9):750-753.
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  (收稿日期:2013-05-16 本文編輯:魏玉坡)

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